Summary
Здесь мы предлагаем практическую процедуру препарирования и проведения гистологического анализа и анализа экспрессии генов надключичной бурой жировой ткани мышей.
Abstract
Опосредованный бурой жировой тканью (BAT) термогенез играет важную роль в регуляции метаболизма, и на его морфологию и функцию могут сильно влиять стимулы окружающей среды у мышей и людей. В настоящее время мышиный межлопаточный BAT (iBAT), который расположен между двумя лопатками в верхнем дорсальном боку мышей, является основным хранилищем BAT, используемым исследовательскими лабораториями для изучения функции BAT. Недавно у мышей было идентифицировано несколько ранее неизвестных депо BAT, в том числе одно, аналогичное надключичной коричневой жировой ткани человека. В отличие от iBAT, мышиная надключичная бурая жировая ткань (scBAT) расположена в промежуточном слое шеи и, таким образом, не может быть легко доступна.
Чтобы облегчить изучение недавно идентифицированного мышиного scBAT, в настоящем документе представлен протокол с подробным описанием шагов по препарированию интактного scBAT у постнатальных и взрослых мышей. Из-за небольшого размера scBAT по сравнению с другими жировыми депо, процедуры были модифицированы и оптимизированы специально для обработки scBAT. Среди этих модификаций – использование препарирующего микроскопа во время забора тканей для повышения точности и гомогенизации замороженных образцов scBAT для повышения эффективности последующего анализа кПЦР. С помощью этих оптимизаций можно определить идентификацию, морфологический вид и молекулярную характеристику scBAT у мышей.
Introduction
Растущая распространенность ожирения в США и во всем мире вызвала большой интерес к пониманию его этиологии и выявлению потенциальных методов лечения 1,2. Жировая ткань играет жизненно важную роль в обмене веществ, и дисрегуляция жировой ткани может привести к развитию ожирения. Как правило, существует два типа жировой ткани: белая и коричневая жировая ткань. В то время как белая жировая ткань (ВАТ) может накапливать химическую энергию и выделять эндокринные факторы, бурая жировая ткань (БАТ) может использовать химическую энергию для выработки тепла и поддержания температуры телана холоде. Благодаря этой уникальной способности активация БАТ также может увеличить расход энергии и улучшить чувствительность к инсулину5.
BAT выполняет свою функцию посредством недрожащего термогенеза, процесса, опосредованного развязкой белка 1 (UCP1)6. Млекопитающие, в том числе мыши и люди, обладают разным количеством BAT. Классическая точка зрения БАТ заключается в том, что эти жировые ткани более распространены у мышей и младенцев, чем у взрослых людей. iBAT, расположенный в верхней дорсальной области между лопатками, является наиболее изученным депо BAT у мышей. Применяя радиоизотопную визуализацию и биопсийные тесты, недавние исследования выявили несколько депо БАТ у взрослых людей. Некоторые из них, в том числе депо, обнаруженные в глубокой шейке и надключичной области, ранее не были идентифицированы у мышей или других модельных животных 7,8,9,10,11. Среди этих депо BAT, scBAT является наиболее часто встречающимся депо у взрослых людей. Чтобы лучше понять происхождение и молекулярный вклад этих недавно обнаруженных депо BAT в организме человека, важно идентифицировать эквивалентные депо у мышей, которые позволяют генетическим и молекулярным манипуляциям отслеживать и тестировать функциональную роль этих депо. Таким образом, мы и другие ученые идентифицировали несколько ранее неизвестных депо BAT в различных анатомических местах у мышей, включая scBAT12,13, грудной периваскулярный BAT14,15, околопочечный BAT16 и периаортальный BAT17. Мышиный scBAT анатомически напоминает человеческий scBAT и морфологически напоминает классический iBAT, экспрессируя высокие уровни UCP112.
В отличие от мышиного iBAT, который легко поддается вскрытию, scBAT располагается в промежуточном слое шеи мыши, под слюнными железами и вдоль наружной яремной вены. Выделение этого депо для гистологического и молекулярного анализов может быть сложной задачей. Здесь мы подробно опишем процедуру препарирования scBAT у постнатальных и взрослых мышей и обработки этого депо для гистологии и анализа экспрессии генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинском колледже Бэйлора. Все процедуры проводились на самцах мышей C57BL/6J в возрасте 3 недель и 3 месяцев. Перед вскрытием все мыши были подвергнуты эвтаназии с использованием одобренной процедуры эвтаназии углекислым газом для грызунов. См. Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и инструментами, используемыми в этом протоколе.
1. Вскрытие scBAT
- Положите тушку мыши на верстак и очистите хирургические ножницы и щипцы с тонким концом 70% этанолом.
- Опрыскайте брюшную шею мыши 70% этанолом, чтобы намочить шерсть и свести к минимуму загрязнение шерсти.
- Сделайте двусторонний разрез, примерно 1,5 см, вдоль ключиц.
- От концов предыдущего надреза разрежьте продольно по направлению к ушам, длиной примерно 1 см. В результате образуется квадратный U-образный разрез вокруг шеи (Рисунок 1A, B).
ПРИМЕЧАНИЕ: scBAT находится в промежуточном слое шеи. На этом этапе обнажается поверхностный слой, состоящий из кожи, подкожно-жировой клетчатки и слюнных желез. Промежуточный слой, наряду с scBAT, содержит яремные вены и мышцы шеи. Глубокий слой шеи, содержащий глубокую шейную БАТ и артерию и яремные вены, обнажается путем удаления скелетной мышцы. - Поместите мышь под препарирующий микроскоп и сфокусируйте обнаженную шею (рис. 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот дополнительный шаг значительно повышает точность забора ткани, что необходимо, учитывая небольшой размер scBAT. - Полностью обнажите слюнные железы, приподняв разрезанные участки кожи щипцами.
- С помощью хирургических ножниц и щипцов разъедините ткань, соединяющую слюнные железы, с тканью вокруг ключиц и друг с другом.
- Обнажайте депо scBAT, приподнимая слюнные железы. Ищите БАТ вдоль наружной яремной вены и, возможно, соединенную с нижней стороной слюнных желез. Определите его по оранжеватому цвету, который выделяется на фоне окружающих тканей.
- Удерживают целевую жировую ткань щипцами и аккуратно отклеивают ее от слюнных желез.
- После отделения от слюнных желез продолжайте отсоединять scBAT от наружной яремной вены и мускулатуры шеи до тех пор, пока депо по обе стороны шеи не будут удалены целиком.
- Осмотрите каждый препарированный образец scBAT под препарирующим микроскопом (рис. 1D, E), используя щипцы, чтобы удалить оставшуюся соединительную ткань.
- Поместите каждый образец в стеклянный сцинтилляционный флакон, содержащий 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), и извлеките мышь из-под микроскопа.
2. Обработка и окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) scBAT (проиллюстрировано на рисунке 2A)
- Замените PBS (шаг 1.12) 10 мл холодного 4% параформальдегида (PFA) и поместите флакон на нутатор, раскачивая при температуре 4 °C в течение ночи, чтобы зафиксировать scBAT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионная фиксация может быть применена в постнатальном периоде, особенно у взрослых мышей, когда необходима дальнейшая обработка для иммуногистохимического анализа. - На следующий день стерильной трансферной пипеткой извлеките раствор ПФА из флакона и замените его 10-15 мл ПБС. Поместите флакон на нутатор и покачайте на 30 минут при комнатной температуре. Замените ПБС 0,85% физиологическим раствором и продолжайте качать еще 30 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Солевой раствор представляет собой 0,85% физиологического раствора (NaCl) в воде, обработанной ДЭПК (без РНКазы). PBS может быть заменен физиологическим раствором на этом и следующем этапе. - Удалите 0,85% физиологический раствор с помощью трансферной пипетки и добавьте во флакон 10 мл 70% этанола/0,85% физиологического раствора. Храните флакон в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи или до тех пор, пока он не будет готов для введения парафина.
ПРИМЕЧАНИЕ: PBS можно использовать, если 0,85% физиологический раствор недоступен. scBAT должен быть обработан как можно скорее для облегчения секционирования и лучшей сохранности морфологии тканей. - Перед введением парафина обезвоживайте scBAT с помощью серии обменов этанола, чтобы удалить воду из ткани.
- Для начала удалите 70% этанол/0,85% физиологический раствор из флакона с помощью трансферной пипетки и добавьте 10-15 мл 95% дегидрантного спирта, покачивая флакон на нутаторе при комнатной температуре в течение 1 ч. Повторите этот шаг один раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол можно использовать вместо спиртовых растворов дегидранта. - Затем замените 95% дегидрантный спирт 10-15 мл 100% дегидрантного спирта и продолжайте качать на нутаторе в течение 1 часа. Долейте новый 100% дегидрантный спирт и продолжайте качать в течение нескольких часов или ночи, в зависимости от количества scBAT во флаконе.
- Для начала удалите 70% этанол/0,85% физиологический раствор из флакона с помощью трансферной пипетки и добавьте 10-15 мл 95% дегидрантного спирта, покачивая флакон на нутаторе при комнатной температуре в течение 1 ч. Повторите этот шаг один раз.
- Чтобы очистить скБАТ для встраивания, добавьте 10 мл толуола во флакон и продолжайте качать на нутаторе до тех пор, пока скБАТ не станет прозрачным, примерно 6-8 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность времени, необходимого для достижения удовлетворительной очистки, зависит от размера scBAT. Рекомендуется начинать расчистку сразу утром, чтобы во второй половине дня могла произойти инфильтрация и заделка. - Чтобы внедрить scBAT в парафин, удалите толуол и добавьте во флакон 10 мл расплавленного инфильтрационного парафина. Поместите флакон в духовку при температуре 65 °C на 1 час. Повторите этот шаг с новым воском.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начните плавить восковые гранулы в духовке в течение ночи перед началом заделки, чтобы убедиться, что воск полностью жидкий. - Замените инфильтрационный парафин на заделочный парафин и поместите флакон при той же температуре на 1 ч. Повторите этот шаг один раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стадия инфильтрации может быть прервана и продолжена позже. Выньте флакон из духовки и храните его при комнатной температуре до тех пор, пока он не будет готов. - Поместите ткань, сначала поместив ее в форму для заделки ткани, добавьте расплавленный воск для закладки в форму и переориентируйте ткань под стереомикроскопом. Затем поместите кассету для закладки поверх воска и продолжайте заливать ее поверх воска, пока она не заполнится, а закладной колпачок не будет прикреплен к восковому блоку. Переложите блок в холодильник с температурой 4 °C на ночь, чтобы воск затвердел и дал усадку, прежде чем снимать металлическую форму.
- Разрежьте scBAT микротомом до толщины 5-6 мкм18, по три-четыре среза на предметное стекло микроскопа, и поместите в теплую парафиновую секцию флотационной ванны при температуре ~42 °C, чтобы срезы тканей разгладились.
- Перенесите секции на направляющие и поставьте их вертикально напротив плавучей ванны, чтобы вода стекала с направляющих.
- Переложите предметные стекла на решетку для окрашивания из нержавеющей стали и поместите решетку на стол для сушки слайдов на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Парафиновые предметные стекла можно хранить в течение длительного времени при комнатной температуре, прежде чем будет достигнута дальнейшая обработка. - Выполните окрашивание H&E19. Для начала поместите предметные стекла в штатив для окрашивания, затем поместите штатив в банку для окрашивания с ксилолом на 40 с. Повторите этот шаг один раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если парафин все еще виден после двух этапов, подождите, пока он полностью не растворится, прежде чем продолжить. - Чтобы регидратировать ткань, поместите подставку для выкрашивания в банку для окрашивания, наполненную 100% дегидрантным спиртом, на два 20-секундных этапа, затем 15-секундный этап в 95% дегидрантном спирте и заключительный 15-секундный ополаскиватель в ddH2O.
- Поместите предметные стекла в чашку для окрашивания, наполненную раствором гематоксилина, на 75 с для достижения ядерного окрашивания, затем промойте предметные стекла в чашке для окрашивания ddH2O в течение 45 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время можно регулировать в зависимости от желаемого цвета пятна. - Дифференцируйте окрашивание, окунув предметные стекла в посуду для окрашивания, наполненную раствором HCl-этанола, на 15 с, затем перенесите предметные стекла в другую промывку ddH2O на 15 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор HCl-этанола готовят в соответствии с опубликованным методом19. - Для цитоплазматического окрашивания поместите предметное стекло в раствор для противоокрашивания Eosin Y на 15 с.
- Обезвоживайте ткани, погружая предметные стекла на 15 секунд каждый в три последовательных этапа раствора 95% дегидрантного спирта, затем две последовательные 100% дегидрантные спиртовые ванны - первая на 15 с, а вторая на 45 с - для завершения обезвоживания.
- Наконец, перенесите предметные стекла в ванну с ксилолом на 45 с, чтобы реакклиматизировать ткань к органическим растворителям. После этого этапа окрашивание завершено; Извлеките ткань из раствора.
- Нанесите монтажный материал на каждую направляющую и поместите ее в химический вытяжной шкаф. Высушите в течение ночи перед визуализацией. Результаты визуализации показаны на рисунке 2B.
3. Анализ экспрессии генов scBAT
- Сбор тканей (шлифовка)
- После препарирования scBAT сразу же поместите ткань в микроцентрифужную пробирку, проткните отверстие в верхней части пробирки стерильной иглой и заморозьте в жидком азоте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Основные этапы протокола, описанные здесь, проиллюстрированы на рисунке 3A. Протыкание отверстия в верхней части трубки перед тем, как опустить ее в жидкий азот, предотвращает разрыв трубки из-за резкого изменения давления. - Наполните пластиковый стакан жидким азотом и оставьте пестик и тонкую лопатку для пропитки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно поддерживать температуру всех инструментов и образцов тканей как можно более холодную, близкую к температуре жидкого азота, в течение всей процедуры, чтобы предотвратить оттаивание ткани. Размороженная жировая ткань очень адгезивна и усложняет опудривание. Извлекайте инструменты и образцы из ванн с жидким азотом только непосредственно перед использованием. - Возьмите по одному замороженному образцу ткани за раз и вылейте его из пробирки микроцентрифуги в раствор.
- Добавьте в ступку небольшое количество жидкого азота, затем пестиком измельчите замороженную ткань до полного измельчения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань начинает становиться мягкой или липкой в какой-либо момент, она оттаивает; Налейте в раствор больше жидкого азота. - С помощью тонкого шпателя осторожно соскребите и перенесите измельченную ткань обратно в пробирку микроцентрифуги. Налейте жидкий азот в раствор во время соскребания, чтобы собрать оставшиеся кусочки ткани, прежде чем переносить шпателем. Повторяйте этапы переноса до тех пор, пока вся ткань не будет удалена из раствора.
- Очистите раствор с помощью легкого тканевого салфетки и 70% этанола перед тем, как высыпать следующий образец для измельчения. Храните измельченные в порошок салфетки в морозильной камере при температуре -80 °C длительное время.
- После препарирования scBAT сразу же поместите ткань в микроцентрифужную пробирку, проткните отверстие в верхней части пробирки стерильной иглой и заморозьте в жидком азоте.
- Выделение общей РНК
- Подготовка
- Очистите верстак, пипетки, держатели наконечников и штативы для пробирок 70% этанолом и обеззараживающим средством для поверхности, чтобы удалить РНКазу.
- Запустите центрифугу до достижения температуры 4 °C.
- Раствор элюирования подогреть до 70 °С.
- Разбавляют ДНКазу I, смешивая 5 мкл восстановленной ДНКазы I с 75 мкл раствора для разведения ДНКазы на образец. Поместите раствор ДНКазы I на лед до использования.
- Процедура
- Для каждого образца промаркируйте две пробирки для микроцентрифуг, две пробирки для хранения колонок (две градуированные пробирки для микроцентрифуг без крышек) и одну связующую мини-колонку.
- Добавьте 500 мкл раствора для выделения РНК в каждый образец и проведите ультразвуковую обработку с помощью грануляторного пестик-мотора в течение 30 секунд.
- Возьмите шприц для каждого образца и пропитывайте пипетку вверх и вниз 10 раз для дальнейшего лизиса ткани. Убедитесь, что после спринцевания не видно твердых частиц.
- Добавляйте 250 мкл хлороформа и время от времени перемешивайте, ожидая 5 минут, пока образцы не инкубируются при комнатной температуре.
- Центрифуга при 21 000 × г в течение 20 мин при 4 °C.
- Переложите верхнюю водную часть в новую микроцентрифужную пробирку и добавьте эквивалентное количество 70% этанола (~500 мкл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя водная часть должна быть прозрачной, нижняя должна быть красным раствором для выделения РНК, а между двумя слоями должны быть некоторые нежелательные твердые частицы. - Перенесите 500 мкл нового лизата в связующую колонку. Центрифугу при 18 000 × г в течение 60 с, а затем фильтрат выбросить.
- Повторите предыдущий шаг с оставшимся лизатом, чтобы вся РНК попала в связывающую колонку.
- Добавьте 700 мкл промывки с низкой жесткостью в обвязочную колонку, центрифугируйте в течение 30 секунд и выбросьте фильтрат.
- Добавьте 80 мкл разбавленной ДНКазы I в каждую связывающую колонку. Выдерживать 15 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 700 мкл промывки высокой жесткости, центрифугируйте в течение 30 секунд и выбросьте фильтрат.
- Добавьте 700 мкл промывки низкой жесткости, центрифугируйте в течение 60 секунд и выбросьте фильтрат.
- Переместите обвязочные колонны во2-ю новую колонку без колпачка и центрифугу на 2 минуты, чтобы убедиться, что все жидкости удалены из обвязочной колонны.
- Переместите связывающие колонки в новую пробирку микроцентрифуги и добавьте 30 мкл подогретого элюирующего раствора. Выдерживают при комнатной температуре 1 мин.
- Центрифуга в течение 2 мин собирает элюированную РНК на дне пробирки микроцентрифуги.
- Измерьте общую концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если общая чистота РНК низкая, на что указывает значение 260/280 ниже 2,0 или значение 260/230 ниже 1,8, то после этапа 3.2.2.12., образцы можно еще раз промыть промывкой низкой строгости, а затем промыть 80% этанолом, прежде чем перейти к этапу 3.2.2.13. - Храните РНК в морозильной камере при температуре -80 °C.
- Обратная транскрипция (RT)
- В полоску для ПЦР добавьте 0,5-1 мкг общей РНК, разбавленной в воде, обработанной DEPC, до 8 мкл для каждого образца РНК в отдельную лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество РНК, используемой для обратной транскрипции, может быть увеличено или уменьшено в соответствии с инструкциями производителя. - Добавьте 1 мкл Oligo dT и 1 мкл dNTP к каждому образцу в пробирке для ПЦР. Убедитесь, что общий объем составляет 10 мкл на образец.
- Поместите полоску пробирки для ПЦР в амплификатор и установите ее на 65 °C на 5 минут, а затем на 4 °C на неопределенный срок.
- Через 5 мин при 65 °C выньте полоску для ПЦР-пробирки и поместите пробирку на лед минимум на 2 минуты. После инкубации на льду добавьте в каждый образец пять реагентов: 4 мкл 5-цепочечного буфера, 2 мкл 25 мМ MgCl2, 2 мкл 0,1 М DTT, 1 мкл ингибитора РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы. Убедитесь, что общий объем составляет 20 мкл на образец.
- Поместите полоску пробирки для ПЦР обратно в амплификатор и установите программу на 50 °C на 50 минут, затем на 85 °C на 5 минут, затем на 4 °C на неопределенный срок.
- Как только программа достигнет 4 °C, выньте полоску и добавьте 1 мкл рибонуклеазы H (РНКазы H).
ПРИМЕЧАНИЕ: РНКаза H используется для удаления любой оставшейся РНК-матрицы в реакции RT; На этом этапе искомая РНК уже должна быть преобразована в кДНК. - Поместите полоску обратно в амплификатор и работайте при температуре 37 °C в течение 20 минут, а затем 4 °C на неопределенный срок.
- Обратная транскрипция завершена; измеряют концентрацию кДНК с помощью спектрофотометра.
- Разбавляют кДНК до 250 нг/мкл; храните кДНК в морозильной камере при температуре -80 °C или -20 °C.
- В полоску для ПЦР добавьте 0,5-1 мкг общей РНК, разбавленной в воде, обработанной DEPC, до 8 мкл для каждого образца РНК в отдельную лунку.
- Количественная ПЦР (кПЦР)
- Составьте электронную таблицу, чтобы упорядочить положение каждого праймера и образца на 96-луночном планшете для кПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один из праймеров должен быть референсным геном, чтобы нормализовать экспрессию всех других интересующих генов, таких как 36B4. - Сделайте мастер-микс для каждой комбинации «праймер + образец». В каждую лунку для реакции кПЦР добавьте 3 мкл воды молекулярно-биологического класса, 5 мкл основной смеси ферментов для кПЦР, 0,5 мкл прямого праймера и 0,5 мкл обратного праймера, что в сумме составляет 9 мкл на реакцию. Добавьте 1 мкл кДНК на реакцию, чтобы получить в общей сложности 10 мкл на реакцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартом является наличие трех технических реплик для каждой комбинации «праймер + сэмпл», поэтому каждый мастер-микс должен быть в 4 раза больше вышеуказанных количеств. - Добавьте 1 мкл кДНК для каждого репликата в каждую мастер-смесь праймера. Если каждая мастер-смесь состоит из 4 мкм, то пипетируют 4 мкл каждого образца кДНК в его собственную меченую пробирку.
- Наконец, пипетку 10 мкл каждой реакционной смеси в 96-луночный планшет для кПЦР в положениях, определенных электронной таблицей.
- Запечатайте планшет толстым клейким уплотнением, а затем центрифугируйте 96-луночный планшет при 450 × г при 20 °C в течение 2 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы планшет был полностью герметичным, чтобы избежать испарения образцов во время термоциклирования. Используйте легкие тканевые салфетки, чтобы прижать уплотнение к пластине, особенно к краям. - Запустите планшет в приборе для ПЦР в реальном времени. Запрограммируйте реакцию ПЦР в соответствии с инструкциями производителя: 2 мин при 50 °C, затем еще 2 мин при 95 °C и, наконец, 40 циклов по 15 с при 95 °C и 30 с при 60 °C. Результаты анализа экспрессии генов методом кПЦР представлены на рисунке 3Б.
- Составьте электронную таблицу, чтобы упорядочить положение каждого праймера и образца на 96-луночном планшете для кПЦР.
- Подготовка
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В отличие от iBAT, который располагается в подкожном слое спины между двумя лопатками, scBAT располагается в промежуточном слое шеи, простираясь глубоко между слоями скелетных мышц и слюнной железы по мере роста вдоль наружной яремной вены (рис. 1A). Препарирование scBAT не так просто, как в iBAT. Здесь мы приводим подробную процедуру, включающую важнейшие этапы препарирования интактного scBAT у постнатальных и взрослых мышей (рис. 1B, C). После вскрытия шеи по предоставленному протоколу под препарирующим микроскопом можно определить тонкий слой scBAT и отделить его от соединенной слюнной железы и наружной яремной вены с помощью пары щипцов (рис. 1D, E). Для оценки морфологии депо свежевыделенный scBAT обрабатывали с использованием предложенной процедуры обработки в сочетании с ранее опубликованной процедурой окрашивания H&E19 (рис. 2A). Как показано на рисунке 2B, scBAT обладает тканевыми структурами, типичными для BAT-депо, и состоит из множества маленьких мультилокулярных адипоцитов у здоровых постнатальных и взрослых мышей. Для оценки уровней экспрессии генов в scBAT РНК выделяли из изолированных депо scBAT с использованием предложенных процедур (рис. 3A). Затем уровни экспрессии интересующих генов могут быть оценены стандартными методами ОТ-кПЦР (рис. 3A). Как показано на рисунке 3B, дифференциальные уровни экспрессии генов, участвующих в опосредовании функции scBAT, включая Pparg, главный регулятор развития BAT; Fabp4 и Glut4, два переносчика питательных веществ; и Ucp1 и Ppargc1a, два гена, участвующие в термогенезе, могут быть легко определены. Для сравнения РНК выделяли из изолированного iBAT, а экспрессию перечисленных выше генов также оценивали с помощью предложенных процедур (рис. 3А). Уровни экспрессии этих генов относительно схожи между этими двумя депо. (Рисунок 3Б).
Рисунок 1: Анатомическое расположение scBAT и процесс его рассечения. (A) Расположение scBAT в промежуточном слое шеи. (Б) Поверхностный слой шеи до и после удаления кожи. Масштабная линейка = 250 мкм. Пунктирными желтыми линиями очерчивается область, которая должна быть обнажена после выполнения U-образного разреза. (C) Изображение туши мыши, помещенной под препарирующий микроскоп для повышения визуальной четкости во время вскрытия. (Д,Э) Репрезентативные изображения промежуточного слоя шеи до и после scBAT удаляют у мышей в возрасте 3 недель и 3 месяцев. Масштабная линейка = 250 мкм. Пунктирными желтыми линиями обведены открытые двусторонние склады scbat; n = 2. Сокращения: scBAT = надключичная бурая жировая ткань; sfi = поверхностный слой; sg = слюнная железа; tr = трахея; jv = наружная яремная вена; sm = скелетная мускулатура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обработка scBAT для окрашивания H&E. (A) Блок-схема, иллюстрирующая основные этапы обработки scBAT для окрашивания H&E. После препарирования ткани ее последовательно фиксируют, обезвоживают, встраивают, секционируют и окрашивают. (B) Репрезентативные изображения окрашенных H&E-scBAT мышей в возрасте 3 недель и 3 месяцев; n = 3 для каждой стадии развития; масштабная линейка = 250 мкм для изображений с меньшим увеличением; Масштабная линейка = 50 мкм для изображений с большим увеличением. Сокращения: scBAT = надключичная бурая жировая ткань; PFA = параформальдегид; H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Подготовка РНК из scBAT для анализа экспрессии генов. (A) Блок-схема, иллюстрирующая этапы выделения РНК и анализа экспрессии гена scBAT методом ОТ-кПЦР. Из-за небольшого размера и мягкой текстуры быстрое замораживание депо scBAT и измельчение его в жидком азоте имеет решающее значение для успешного выделения РНК. (B) Относительная экспрессия маркерных генов, включая Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 и Ppargc1a, в scBAT и iBAT, выделенных от самцов мышей в возрасте 3 месяцев, n = 5. Данные представлены в виде среднего ± SEM. 36B4 был использован в качестве гена, ответственного за хозяйство для нормализации. Сокращения: scBAT = надключичная бурая жировая ткань; ОТ-кПЦР = ПЦР с обратной транскрипцией; LN2 = жидкий азот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы подробно представляем процедуры препарирования и обработки scBAT для анализа H&E и экспрессии генов. Поскольку scBAT находится в промежуточном слое шеи и располагается вдоль крупных вен, выделение этого депо требует точной техники. В частности, чтобы получить четкое представление о складе, мы рекомендуем поместить мышь под препарирующий микроскоп после того, как горлышко было открыто. Используя пару тонких щипцов для отклеивания слюнной железы и окружающих вен, следует соблюдать осторожность, чтобы избежать прокола вен. Чрезмерное кровотечение может затруднить обнаружение scBAT. Для обработки scBAT для окрашивания H&E мы адаптировали использование опубликованного протокола19 с небольшими изменениями, включив в него использование 4% PFA, дегидрантных спиртов и органического растворителя толуола для обработки тканей, как показано в разделе протокола. Вся процедура занимает ~6 дней, а слайды, окрашенные H&E, можно сфотографировать на следующий день после завершения окрашивания.
ОТ-кПЦР с использованием РНК в качестве исходного материала является наиболее часто используемым методом анализа экспрессии генов в области биологии жировой ткани. Поскольку scBAT является относительно небольшим депо BAT по сравнению с iBAT, получение достаточного количества РНК для экспрессии генов может быть затруднено. Чтобы увеличить выход РНК, мы рекомендуем применять последовательные этапы подготовки лизата, как описано в разделе протокола, начиная с припудривания ткани с помощью пестика и ступки во время замораживания. Используя этот метод получения лизата, мы успешно получили высокопродуктивный и высококачественный образец РНК для анализа экспрессии генов scBAT от одной взрослой мыши. Этот метод получения лизата также может быть применен для получения высококачественных белковых лизатов из scBAT для вестерн-блоттинга с использованием буфера для лизиса белка.
Используя мышиный iBAT, исследователи получили существенные знания о функции BAT в термогенезе и метаболизме. Недавняя идентификация нескольких ранее неизвестных депо БАТ у мышей и людей, включая scBAT, показала необходимость проведения дополнительных исследований, прежде чем мы сможем полностью понять физиологический вклад БАТ у мышей и взрослых людей. В частности, необходимы исследования, проливающие свет на происхождение, функции и участие этих недавно обнаруженных депо BAT в термогенезе и регионарном или общеорганизменном метаболизме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается NIDDK Национального института здравоохранения (NIH) под номером R01DK116899, Министерством сельского хозяйства США (USDA/ARS) под номером 3092-51000-064-000D и пилотной премией от Института сердечно-сосудистых исследований Медицинского колледжа Бэйлора. Блок-схемы были созданы с помощью BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
- Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).
- Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370 (2021).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796 (2017).
- Berry, R., et al.
