Summary
Genç sıçanın bel sarnıcına enjeksiyon yapmak için cerrahi bir prosedür tarif edilmiştir. Bu yaklaşım, gen terapisi vektörlerinin intratekal verilmesi için kullanılmıştır, ancak bu yaklaşımın hücreler ve ilaçlar dahil olmak üzere çeşitli terapötikler için kullanılabileceği tahmin edilmektedir.
Abstract
Gen terapisi, işlevsel bir geni tanıtmak, toksik bir geni etkisiz hale getirmek veya ürünü hastalığın biyolojisini modüle edebilen bir gen sağlamak için olsun, hastalığın tedavisi için bir hastaya yeni genler sağlamak için güçlü bir teknolojidir. Terapötik vektör için uygulama yöntemi, sistemik uygulama için intravenöz infüzyondan hedef dokuya doğrudan enjeksiyona kadar birçok şekilde olabilir. Nörodejeneratif bozukluklar için, transdüksiyonun beyne ve / veya omuriliğe doğru çarpıtılması genellikle arzu edilir. Tüm merkezi sinir sistemini hedeflemek için en az invaziv yaklaşım, beyin omurilik sıvısına (BOS) enjeksiyonu içerir ve terapötiğin merkezi sinir sisteminin büyük bir kısmına ulaşmasını sağlar. Bir vektörü BOS'a iletmek için en güvenli yaklaşım, omuriliğin bel sarnıcına bir iğnenin sokulduğu lomber intratekal enjeksiyondur. Lomber ponksiyon olarak da bilinen bu teknik, yenidoğan ve yetişkin kemirgenlerde ve büyük hayvan modellerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Teknik, türler ve gelişim aşamaları arasında benzer olsa da, intratekal boşluğu çevreleyen dokuların boyut, yapı ve elastikiyetindeki ince farklılıklar, yaklaşımda konaklama gerektirir. Bu makale, adeno ilişkili bir serotip 9 vektörü sağlamak için juvenil sıçanlarda lomber ponksiyon gerçekleştirme yöntemini açıklamaktadır. Burada lomber rezervuara 25-35 μL vektör enjekte edildi ve her enjeksiyondan elde edilen transdüksiyon profilini değerlendirmek için yeşil floresan protein (GFP) raportörü kullanıldı. Bu yaklaşımın yararları ve zorlukları tartışılmaktadır.
Introduction
Viral aracılı gen terapilerinin vaadi, son yıllarda spinal müsküler atrofi, retinal distrofi, faktör IX hemofili, kanser ve daha fazlası için tedavilerin FDA onayı ile nihayet gerçekleşmiştir 1,2,3,4. Sayısız başka terapötik şu anda geliştirilme aşamasındadır. Gen terapisi, bir hastanın hücrelerine terapötik bir gen iletmeyi amaçlar. Bu yeni genin ürünleri, eksik bir endojen genden eksik aktivitenin yerini alabilir, toksik bir geni inhibe edebilir, kanserli hücreleri öldürebilir veya başka bir yararlı işlev sağlayabilir.
Merkezi sinir sistemini (CNS) etkileyen hastalıklar için, gen terapisi vektörünün doğrudan hedef dokuya verilmesi genellikle arzu edilir. Sistemik olmayan yaklaşımlar iki fayda sağlar: periferik transdüksiyonun neden olabileceği hedef dışı yan etkileri en aza indirirler ve hedef dokuda yeterli transdüksiyon seviyelerine ulaşmak için gereken vektör miktarını büyük ölçüde azaltırlar5.
Gen terapisi vektörlerini CNS'ye iletmek için çeşitli yaklaşımlar vardır. Bir vektörün doğrudan omuriliğe veya beyin dokusuna enjekte edilmesi olan intraparankimal enjeksiyon, tanımlanmış bir bölgeye vermek için kullanılabilir. Bununla birlikte, birçok hastalık için, CNS'nin geniş transdüksiyonu arzu edilir. Bu, beyin ve omurilik içinde ve çevresinde akan sıvı olan beyin omurilik sıvısına (BOS)5 bir vektör verilerek gerçekleştirilebilir. Vektörleri CSF'ye iletmenin üç ana yolu vardır. En invaziv yaklaşım, kafatasından bir çapak deliği açmayı ve beyinden lateral ventriküllere bir iğne ilerletmeyi içeren intraserebroventriküler doğumdur. Bu, beyin boyunca transdüksiyon sağlar. Bununla birlikte, prosedür intrakraniyal kanamaya neden olabilir ve yaklaşım genellikle omuriliğin sadece sınırlı transdüksiyonunu sağlar6. Kafatasının tabanındaki cisterna magna'ya enjeksiyon daha az invazivdir, ancak beyin sapına zarar verme riski taşır. Hayvan araştırmalarında sıklıkla kullanılsada5, cisterna magna'ya enjeksiyon artık klinikte rutin olarak kullanılmamaktadır7. Lomber ponksiyon, BOS'a erişmek için en az invaziv yaklaşımdır. Bu, iki bel omuru arasına ve bel sarnıcına bir iğne yerleştirilmesini içerir.
Vektör iletimi için lomber ponksiyon, yetişkin sıçanlarda ve farelerde ve yenidoğan farelerde rutin olarak gerçekleştirilir 8,9. Bu çalışmanın yazarları yakın zamanda adeno ilişkili virüs serotip 9 (AAV9) vektörleri sağlamak için genç sıçanlarda (28-30 günlük) lomber ponksiyonlar gerçekleştirdiler. Yetişkin sıçanlarda, L3 ve L4 omurları9 arasına dikey olarak bir neonatal lomber ponksiyon iğnesi yerleştirildi. Doğru yerleştirme, bir kuyruk hareketi ve BOS'un iğne haznesine akmasına neden olur. Bununla birlikte, genç sıçanlarda, bu okumaların hiçbiri elde edilemedi. Yazarlar daha sonra L5 ve L610 arasında bir açıyla yerleştirilmiş 27 G'lik bir insülin şırıngası kullanarak yetişkin bir fare prosedürünü uyarlamaya çalıştılar. Tipik olarak P28 sıçanlarından daha küçük olan yetişkin farelerde, bu bir kuyruk hareketine neden olmaz, ancak yanlış iğne yerleşimi, enjeksiyonun geri akışı ile belirgindir. Bununla birlikte, genç sıçanlarda, bu yaklaşım, muhtemelen yetişkin fareler ile omuriliği çevreleyen doku katmanlarının genç sıçanları arasındaki farklı elastikiyetten kaynaklanan, enjekte edilen enklavatın epidural olarak verilmesine eşit şekilde yol açmıştır. Daha sonra kateter yaklaşımları değerlendirildi. Spesifik olarak, lomber sarnıcın durasında ve orta torasik omuriliğe kadar bir kesiden bir kateter sokuldu; Bununla birlikte, bu yaklaşım, enjeksiyon sırasında enjeksiyonun insizyon bölgesinden önemli ölçüde geri akışına yol açmıştır. Kateteri bir kılavuz iğne kullanarak perkütan olarak intratekal boşluğa yerleştirme girişimleri de başarısız oldu. İnterlaminar genişliğin darlığı nedeniyle, kateter muhtemelen rostral laminaya çarpacak ve ilerleymeyecektir.
Burada, juvenil sıçanlarda lomber ponksiyon yoluyla başarılı ve tekrarlanabilir solüsyon iletimi elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım viral vektörler için ve muhtemelen hücreler, farmasötikler ve diğer terapötikler için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada Sprague-Dawley cinsi sıçanlar (28-30 günlük, yaklaşık 90-135 g aralığında kitle, erkek ve dişiler) kullanıldı.
1. Vektörün hazırlanması
- Prosedürün başında AAV9 vektörünü ( Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde çözün.
- Sıvının tamamının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için vektörü içeren mikrosantrifüj tüpünü kısa bir süre masa üstü bir santrifüjde santrifüjleyin.
- Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için mikrosantrifüj tüpünü hafifçe vurun.
2. Kurtarma kafesinin hazırlanması
- Elektrikli battaniyenin üzerine temiz bir kafes yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın), böylece kafesin sadece yarısı battaniyeyle temas eder.
- Battaniyenin sıcaklığını ~37 °C'ye ayarlayın.
3. Cerrahi platformun hazırlanması
- Bir izotermal pedi ( Malzeme Tablosuna bakınız) bir mikrodalga veya su banyosunda 39 ° C'ye ısıtın, böylece içerik sıvı hale gelir.
- İzotermal pedi cerrahi platforma yerleştirin ve temiz bir emici tezgah pedi ile örtün.
4. Hayvan hazırlama
- Sıçanları şeffaf bir kutuda izofluran ile uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Anestezi indüksiyonuna %5 izofluran kullanarak başlayın ve %2'ye ulaşana kadar dakikada %1 azaltın. Hayvanı 3 dakika daha% 2'de tutun.
- Hayvanı tutan kutuyu bir davlumbazın üzerine getirin ve kutuyu açın.
NOT: Bu, cerrahın anesteziye maruz kalmasını sınırlar. - Elektrikli saç kesme makineleri kullanarak hayvanın arkasındaki tüyleri alın.
NOT: Alternatif olarak, tüy dökücü krem veya manuel tıraş bıçağı ve tıraş kremi kullanılabilir. - Hayvanı, burnu anestezi burun konisinde olacak şekilde cerrahi platforma yerleştirin.
NOT: Kürk ameliyat bölgesinden çıkarılırken hayvan bilincini yeniden kazanmaya başlayabilir. Bu olursa, yukarıda anlatıldığı gibi tekrar uyuşturun. - İşlem sırasında korneaların kurumasını önlemek için her göze kayganlaştırıcı göz merhemi sürün.
- Povidon-iyot ve izopropanol mendillerin üç alternatif uygulamasını kullanarak cerrahi alanı dezenfekte edin.
- Analjezik (ler) i deri altına enjekte edin.
NOT: Buprenorfin genellikle her 12 saatte bir verilen 0.01-0.05 mg / kg'lık bir dozda kullanılır. Alternatif olarak, bu ilacın yavaş salınan bir formu, 72 saat boyunca yeterli ağrı kontrolü sağlamak için 1 mg / kg'da bir kez verilebilir. Ağrı yönetimi ile ilgili yönergeleri için kurumun IACUC'sine danışın. - Lokal anestezi sağlamak için L2 ila L6 spinöz işlemlerinin üzerine deri altından 100 μL% 1 lidokain enjekte edin.
- Hayvanın altına bir rulo kağıt havlu veya 1,5 cm çapında bir tüp yerleştirin, sadece kalçalara kadar uzanın. Bu, omurganın esnemesine yardımcı olur ve iğneyi iki lamina arasına sokmayı kolaylaştırır.
- Hayvanın üzerine fenestre bir örtü yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve fenestrasyonu bel omurgası üzerinde ortalayın.
5. Lomber omurganın açığa çıkarılması
- Hayvanın pençelerinin her birini sıkıştırarak ve geri çekilme tepkisinin olmadığını arayarak anestezi derinliğini onaylayın.
- # 11 neşter bıçağı kullanarak, L2'den L6'ya kadar orta hattan aşağı doğru deride yaklaşık 3 cm uzunluğunda bir kesi oluşturun.
- Kas ile cilt arasına steril kavisli bir çift cerrahi makas sokarak ve ardından uçları açarak cildi kastan gevşetin.
- L2-L5 spinöz süreçleri kaplayan fasyayı çıkarın.
6. Şırınganın yüklenmesi
- Vektörün 25-35 μL'sini (istenen dozu elde etmek için) steril bir mikrosantrifüj tüpünün kapağına pipetleyin.
- Tüm hacmi insülin şırıngasına çekin.
NOT: Bu işlem sırasında hava çekmemeye özen gösteriniz.
7. Enjeksiyonun yapılması
- L5 ve L4 spinöz süreçlerini tanımlayın.
NOT: L6 doğrudan iki iliak tepe arasında yer alır ve dikenli sürecinin, künt bir aletle sondalama yoluyla tanımlanması kolay olmalıdır. Cihaz daha sonra L5 ve L4 işlemlerinin sınırlarını bulmak için yavaşça arkaya doğru hareket ettirilebilir. - Bir elinizi, başparmağınız hayvanın kuyruğuna ve bir bacağına nazikçe dayanacak şekilde yerleştirin. Şırıngayı sabitlemek için parmağınızı kullanın.
- Şırınganın iğnesini, L5 dikenli işlemin solunda olacak ve kaudal ucu ile aynı hizada olacak şekilde konumlandırın. Şırıngayı, orta hattan yaklaşık 30° uzakta ve masanın düzleminden 30° yukarıda olacak şekilde konumlandırın.
NOT: Yer işaretlerini daha iyi tanımlamak ve iğnenin ucunu konumlandırmak için cerrahi mikroskop kullanmak yardımcı olabilir. - Şırınga iğnesini yaklaşık 8 mm ileri, L5 laminasının üstünden ve ardından L4 laminasının altından kemiğe vurulana kadar bel rezervuarına ilerletin. Doğru yerleştirme, bacak/kuyruk üzerinde duran başparmak tarafından görülebilen veya hissedilebilen bir bacak ve/veya kuyruk seğirmesine neden olacaktır. Seğirme yoksa, iğneyi çıkarın ve işlemi sol taraftan deneyin. Hala seğirme yoksa, prosedürü gerektiği gibi L4/L3 ve L3/L2 arasında tekrarlayın.
- Pistona yaklaşık 5 saniye boyunca yavaşça bastırın.
NOT: Enjeksiyon sırasında bacakta veya kuyrukta seğirme olabilir. - İğne geri çekildiğinde basıncın dengelenmesini sağlamak ve enjeksiyonun geri akışını en aza indirmek için pistona tamamen bastırdıktan sonra şırıngayı yaklaşık 30 saniye yerinde tutun.
- İğneyi yavaşça çıkarın.
8. Kesinin kapatılması
- Kesiğin kenarlarını yaklaşık olarak ölçün.
- Yaranın bir ucundan başlayarak, kesiyi kapatmak için 4-0 dikiş (Malzeme Tablosuna bakınız) veya cerrahi zımba kullanın.
9. Kurtarma ve izleme
- Hayvanı önceden ısıtılmış kafese yerleştirin.
- Hayvanı tamamen gezdirilene kadar en az 15 dakikada bir kontrol edin.
NOT: Bu işlem 15 dakika ile 45 dakika arasında sürmelidir. - Önümüzdeki üç gün boyunca, en az her gün sağlık kontrolleri yapın. Ameliyattan sonraki ilk 2 gün veya IACUC'un gerektirdiği şekilde analjezik sağlayın.
- Ameliyattan bir hafta sonra dikişleri veya zımbaları çıkarın.
10. Takip prosedürü
NOT: Enjeksiyon tekniğinin doğruluğunu belirlemek için, yukarıda tarif edildiği gibi tripan mavisi boya enjekte edin ve ardından hayvanı hemen ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) ve sonucu görselleştirmek için bir laminektomi yapın.
- Hayvan anestezi altında kalırken, 150 mg / kg'lık bir dozda intraperitoneal enjeksiyon yoluyla öldürücü bir dozda pentobarbital uygulayarak ötenazi yapın.
- Solunum ve kardiyak aktivite durduğunda, ölümü sağlamak için göğüs boşluğunu açın. Cerrahi kesiyi sırttan boynuna kadar uzatın.
- Spinöz işlemlerin her iki tarafında omurgaya paralel kas içine 4 cm uzunluğunda bir kesi yapın ve işlemlere mümkün olduğunca yakın tutun.
- İnce forseps veya makas kullanarak, kasları dikenli süreçler arasından çıkarın.
- Bir rongeur kullanarak L6'dan alt torasik omurgaya kadar olan dikenli süreçleri çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız). Rongeurlara zarar verebileceğinden bükme hareketlerinden kaçının.
- Rongeur'un alt ucunu L5 laminanın altına yerleştirin ve omuriliğin üzerindeki kemiği birkaç "ısırık" alarak çıkarın.
NOT: L6 dikenli işlemi geri çekmek, rongeur'un ucunu yerleştirmeyi kolaylaştırabilir. Omuriliğin zarar görmesini önlemek için özen gösterilmelidir. - Laminektomiyi rostral olarak en az dört lamina genişletmeye devam edin. Laminaların iç yüzeyini, başarısız bir enjeksiyonu gösterebilecek boya belirtileri açısından inceleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enjeksiyon tekniğinin doğruluğunu belirlemek için, terapötik için bir vekil olarak bir boya, tripan mavisi kullanıldı. Bu boya proteinlere kolayca bağlanır, bu nedenle genellikle enjekte edildiği yapı içinde kalır. Bu, boyanın terapötiğin enjeksiyon sonrası dağılımını doğru bir şekilde tahmin edemeyebileceği anlamına gelir; Sadece enjeksiyonun doğruluğunu ortaya çıkarmak için kullanılır. Bel sarnıcına başarılı bir şekilde sokulduğunda, tripan mavisi dura mater'e bağlanır ve omuriliğin çevresini maviye boyar. Bununla birlikte, iğne dura materyale nüfuz edemediğinde, boya epidural boşluğa düşer. Hem dura mater hem de çevresindeki dokular (kemiğin yüzeyi ve laminaları birbirine bağlayan bağlar ve kaslar) maviye boyanacaktır. Bu desenler çıplak gözle kolayca görülebilir.
Doğru ve yanlış uygulanan enjeksiyon arasındaki farkın, omurilik ve omurgadan enine bir kesim yapılıp yapılmadığını değerlendirmek zordur. Bunun yerine, L5 laminadan başlayan ve rostral olarak hareket eden bir çift rongeur kullanarak laminektomi yapılması önerilir. İşlem sırasında dura mater'e zarar vermemeye özen gösterilmelidir. Diseksiyon mikroskobunu kullanmak bu işlemi kolaylaştırır. Şekil 1 , başarılı enjeksiyonların ve sadece kısmen başarılı enjeksiyonların karşılaştırmalı örneklerini sunmaktadır. Başarılı bir enjeksiyonla, iğne geri çekildiğinde iğne izi boyunca çok az reflü gözlenir veya hiç gözlenmez. Başarılı bir enjeksiyonu takiben, omuriliği ortaya çıkarmak için laminanın çıkarılması, omurilik içinde tripan mavisini ortaya çıkarır, ancak kemiğin yüzeyinde ortaya çıkarmaz (Şekil 1A). Boya, başarılı bir enjeksiyonu takiben beyin sapı ve beyincik üzerinde de görülebilir (Şekil 1B). Buna karşılık, kısmen başarılı bir enjeksiyon, enjeksiyon işlemi sırasında iğne yoluna önemli ölçüde boya geri akışı ve/veya kemik üzerinde gözle görülür boya kanıtı ile kanıtlanmıştır (Şekil 1C).
Yukarıdaki prosedür kullanılarak, gelişmiş yeşil floresan proteini (GFP) ifade eden 28 μL bir AAV9 vektörü, toplam 8.4 x 10 11 vektör genomu/hayvan dozu için 3 x10 13 vektör genomu/mL konsantrasyonda enjekte edildi. Dört hafta sonra, hayvanlara ötenazi yapıldı ve% 4 paraformaldehit10 ile perfüze edildi. Beyin ve omurilik daha sonra çıkarıldı ve donmuş kesit için hazırlandı. 40 μm kalınlığında kesitler elde edildi ve GFP için boyandı. Şekil 2, bu vektör ile elde edilen transdüksiyon modelinin örneklerini vermektedir. Transdüksiyon genellikle omurilikte, özellikle lomber bölgede en yüksekti (Şekil 2A-C), muhtemelen enjeksiyon bölgesine yakınlığı nedeniyle. Beynin transdüksiyonu sağlandı (Şekil 2D-F), ancak beklendiği gibi, omurilikte görülenden daha sınırlı olma eğilimindeydi.
Tek bir virüs lotu kullanılarak tek bir deneyimli cerrah tarafından elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğini göstermek için, bu çalışma için enjekte edilen 15 sıçanın her birinden beyincik ve korteksin boyanmış bölümleri sırasıyla Şekil 3 ve Şekil 4'te sunulmuştur. Servikal omuriliğin lekeli kesitleri de bu 15 sıçanın 7'si için sunulmuştur (Şekil 5). Tabii ki, beyin transdüksiyon miktarı farklı dozlar, vektör lotları ve cerrahlar ile daha da büyük değişkenlik gösterebilir10.
Şekil 1: Boya enjeksiyonunu takiben omuriliğin açığa çıkması. Tripan mavisi enjeksiyonunu takiben laminektomiler yapıldı. (A) Doğru uygulanan bir enjeksiyonda omurilik maviye boyanır ve laminektomi sırasında çıkarılan kemikte boya görülmez (oklar). (B) Boya, beyin sapı çevresinde de görülebilir. (C) Enjeksiyon sırasında önemli reflü olan bir enjeksiyonda, kordon içinde daha az boya bulunur ve kemik yüzeyinde boya bulunur (oklar). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: AAV9-GFP'nin intratekal iletimini takiben elde edilen transdüksiyon paternlerinin örnekleri. (A) servikal, (B) torasik ve (C) lomber omuriliğin 40 μm kalınlığındaki kesitleri immünohistokimyasal olarak GFP (siyah leke) için boyandı. Tüm seviyelerde yüksek düzeyde gri madde iletimi gözlendi. (D) Buna karşılık, beyin daha seyrek genel iletim sergiler. Sol ve sağ kutular sırasıyla (E) ve (F) olarak büyütülür. (E) Lekelenmenin çoğunluğu beyincikte, özellikle Purkinje nöronlarında (oklar) görülür. (F) Nöronlar (oklar) ve astrositler (ok uçları) serebral korteks içinde transdüksiyona uğrar. Ölçek çubukları: (A-C) 325 μm; (D) 5 mm; ve (E,F) 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Beyincikte transdüksiyonun tekrarlanabilirliği. Aynı cerrah tarafından aynı doz ve çok sayıda virüs kullanılarak enjekte edilen 15 sıçanın beyincikte transdüksiyonun tekrarlanabilirliği. Ölçek çubuğu: 1 mm. Görüntülerdeki sayılar, sıçan kimlik numaralarını ('çöp') gösterir. bireysel'). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kortekste transdüksiyonun tekrarlanabilirliği. Aynı cerrah tarafından aynı doz ve çok sayıda virüs kullanılarak enjekte edilen 15 sıçanın korteksinde transdüksiyonun tekrarlanabilirliği. Ölçek çubuğu: 500 μm. Görüntülerdeki sayılar, sıçan kimlik numaralarını ('çöp') gösterir. bireysel'). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Servikal omurilikte transdüksiyonun tekrarlanabilirliği. Aynı cerrah tarafından aynı doz ve çok sayıda virüs kullanılarak enjekte edilen 7 sıçanın servikal omuriliğinde transdüksiyonun tekrarlanabilirliği. Ölçek çubuğu: 500 μm. Görüntülerdeki sayılar, sıçan kimlik numaralarını ('çöp') gösterir. bireysel'). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çok çeşitli hastalıklar CNS'yi etkiler. Viral bir vektör aracılığıyla ilgili genin fonksiyonel bir kopyasını sağlamak, spinal müsküler atrofi gibi doğası gereği resesif ve monogenik olanlar için çekici bir tedavi stratejisidir. Bununla birlikte, kan-beyin bariyeri (BBB), intravenöz olarak verilen gen terapisi vektörlerinin çoğunu dışlar11. AAV9 gibi BBB'yi geçebilenler, periferik transdüksiyon12'ye bağlı vektör kaybının üstesinden gelmek için yüksek dozlarda verilmelidir. Yaş da bir engeldir. Çeşitli AAV serotiplerine çevresel maruziyet13 yaşla birlikte artar ve sıklıkla terapötik vektörleri nötralize edebilen antikorların üretimine yol açar14. Bu nedenle, CNS bozuklukları için gen terapisi vektörlerinin intravenöz iletimi genellikle bebeklerle sınırlıdır ve daha sonraki yaşamda teşhis edilen hastalarda kullanılmaz.
Daha yaşlı hastalar için, BOS'a doğrudan vektör enjeksiyonu, hem BBB'yi hem de önceden var olan anti-AAV antikorlarınıatlayarak CNS'de geniş transdüksiyon sağlayabilir 15. Bu yaklaşım hedeflendiğinden, daha düşük vektör dozları da kullanılabilir. Klinik ortamda iki temel yaklaşım vardır: (1) lomber ponksiyon ve (2) lateral ventriküllere enjeksiyon. İkincisi daha fazla risk taşır, ancak genellikle daha fazla beyin transdüksiyonu sağlar. Lomber ponksiyon daha güvenlidir, ancak transdüksiyon omuriliğe doğru çarpıktır. Beyin transdüksiyonu, hastayı Trendelenburg pozisyonuna yerleştirerek geliştirilebilir, ancak bununla ilgili veriler karışıktır16,17. Lomber ponksiyon yoluyla cisterna magna'ya ulaşmak için bir kateter kullanılması klinikte daha iyi bir seçenek sağlayabilir, ancak kullanımın erken bir aşamasındadır5. Hayvan modellerinde işlenen yaklaşımların kliniğe aktarılmasında, BOS sızıntısı18 nedeniyle vektör kaybı ve dorsal kök gangliyonlarında19 toksisite gibi başka zorluklar da olabilir.
Kemirgenlerde gerçekleştirilen CNS'ye yönelik tedavilerin çoğu çalışmada yenidoğanlar veya yetişkin hayvanlar (>60 günlük) kullanılır. Yenidoğanlar, daha yüksek etkili dozlara izin veren küçük bir vücut boyutunun ve terapötik karşı bir bağışıklık tepkisinin komplikasyonlarından kaçınan olgunlaşmamış bir bağışıklık sisteminin avantajına sahiptir. Bununla birlikte, beyin gelişimi açısından, yeni doğmuş bir fare veya sıçan, insanlarda fetal bir aşamayı daha iyi temsil eder. 5-10 yaş aralığındaki çocuklara yönelik tedaviler için, genç sıçan (25-35 günlük) nörolojik gelişim açısından daha iyi bir modeldir20. Daha önce juvenil sıçanlar için intratekal enjeksiyon için bir yöntem tanımlanmadığından ve yetişkin fareler ve sıçanlar için oluşturulan yöntemlerin bu yaştaki sıçanlarda etkisiz olduğu kanıtlandığından, yukarıda açıklanan yaklaşım geliştirilmiştir. Açık olmak gerekirse, genç sıçanlar sadece yetişkinlerden daha küçük olmakla kalmaz, aynı zamanda omuriliği koruyan duranın elastikiyetinde de farklılık gösterebilir, bu da yetişkin bir sıçanda bu tabakayı delmek için çalışan bir prosedürü bir yavruda etkisiz hale getirir.
Juvenil sıçanlarda intratekal enjeksiyonun nasıl gerçekleştirileceğini öğrenirken, terapötik için bir vekil olarak bir boya (tripan mavisi gibi) kullanmak gereklidir ve kullanıcı, bir terapötik ile çalışmaya başlamadan önce prosedürü başarılı ve tekrarlanabilir bir şekilde gerçekleştirme yeteneklerine oldukça güvenmelidir. Teknikte yetkin olmak, yörünge hedef ve hedef dışı olduğunda şırınganın nasıl hissettiği konusunda deneyim kazanmak için pratik yapmayı gerektirecektir. İki yaygın hata vardır. Yaklaşma açısı çok sığsa, iğne laminalardan birinin tepesine veya rostral laminanın arkasına çarpacaktır. Seğirme olmayacak ve iğnenin ilerlediği mesafe 8 mm'den birkaç milimetre kısa olacaktır. Yaklaşma açısı çok büyükse, iğnenin iki lamina arasından geçmesi ve karın boşluğuna nüfuz etmesi riski vardır. Bu olduğunda, iğne 8 mm'den çok daha fazla ilerleyecektir. Böyle bir durumda iğneyi çıkarın, yeniden konumlandırın ve tekrar deneyin. Bunun meydana geldiği birkaç durumda, geri çekilmeden ve yeniden konumlandırılmadan önce karın boşluğuna birkaç milimetre geçici olarak girmek, hayvanlara belirgin bir kalıcı zarar vermemiştir.
İğnenin yerleştirilmesine fiziksel bir tepkinin gözlemlenmesinin, bu prosedürde yüksek bir başarı oranı ile tekrarlanabilirlik elde etmek için kritik olduğu bulunmuştur. Yanıt alınamadığında, enjeksiyonun başarı oranı düşüktü. Bununla birlikte, bazı durumlarda, bir hayvanın bir yanıt elde etmek için birden fazla bölgede girişimlerde bulunulması gerekti ve önceki iğne izlerinin bir veya daha fazlasında eser miktarda boya gözlendi. Epidural boşlukta boya gözlenmedi, bu da önceki iğne çubuklarından bazılarının kuyruk veya bacak seğirmesi oluşturmadan duraya nüfuz ettiğini düşündürdü. Reflü minimal olduğundan (enjeksiyondan iğne izinde gözlenene benzer), bu durumlarda önceki iğne çubuklarının uygulama etkinliği üzerindeki etkisinin ihmal edilebilir olduğu düşünülmektedir.
Doğum tekniğinde yeterlilik kazanıldıktan sonra, cerrahi olmayan ikinci bir zorlukla karşılaşılabilir. Spesifik olarak, yetişkin sıçanlarda (~ 70 günlük), AAV9 vektörlerinin omuriliğe ve beyne intratekal iletim için potansiyeli, aynı vektör çekirdeği tarafından üretilseler bile, partiden partiye önemli ölçüde değişebilir. Bazı partiler beklendiği gibi performans gösterecek ve uzunluğu boyunca omurilik gri maddesinde transdüksiyon sağlayacaktır. Bununla birlikte, diğerleri, öncelikle dorsal kök gangliyonlarını10 dönüştürerek gri maddeye nüfuz edemez. Bu değişkenliğin nedeni belirsizdir, çünkü vektörler in vitro olarak ve doğrudan omuriliğe enjekte edildiğinde güçlüdür. Büyük bir çalışmaya başlamadan önce yeni partinin beklendiği gibi performans gösterdiğini doğrulamak için herhangi bir yeni virüs partisi ile 3-4 hayvandan oluşan bir pilot çalışmanın yapılması önerilir. Potansiyel, protein transgen ürününün immünohistokimyasal veya immünofloresan boyaması veya kantitatif PCR veya ddPCR21 kullanılarak transgen mRNA veya vektör genomlarının miktarının ölçülmesi kullanılarak değerlendirilebilir. Viral lotları ayırt eden bilinmeyen değişkenlere ek olarak, hayvan yaşı, enjeksiyon hacmi, doğum hızı ve vektör konsantrasyonundaki küçük farklılıklar sonuçlarda değişkenliğe neden olabilir. Büyük bir çalışmaya başlamadan önce, her virüs veya diğer aday terapötik ajan için optimize edilmeleri gerekebilir.
Eğitim aldıktan sonra, deneyimli bir cerrah, anestezi indüksiyonundan iyileşme döneminin başlangıcına kadar yaklaşık 30 dakika içinde genç bir sıçanın intratekal enjeksiyon prosedürünü tamamlayabilir. Bu, büyük kohortların kısa sürede tedavi edilmesini sağlar. Ameliyattan iyileşme de hızlıdır. Çoğu hayvan normal olarak 20-30 dakika içinde yürüyor. Bu ameliyatların 200'den fazlası gerçekleştirildikten sonra bu işlemden kaynaklanan herhangi bir yan etki ile karşılaşılmamıştır.
Son olarak, cerrahi prosedürler sırasında hayvan sıkıntısını en aza indirmek ve hayvan refahını sağlamak çok önemli hususlardır. Bu nedenle, anesteziklerin ve analjeziklerin uygun kullanımı gereklidir ve işlem sırasında ve hayvan anesteziden tamamen iyileşene kadar vücut ısısı korunmalıdır. Farklı kurumlardaki ilgili düzenleyici kurumlar ve veterinerlik personelinin bu konularla ilgili farklı gereksinimleri ve önerileri olabilir. Bu prosedürde tarif edilen anesteziklerin ve analjeziklerin kullanımı, Emory Üniversitesi veteriner hekimleri ve IACUC personeli ile istişare içinde geliştirilmiştir. Araştırmacılar, gerekli hedeflere ulaşmak için yerel veteriner hekimleri ve IACUC ile yakın bir şekilde çalışmalıdır.
Bu prosedürün belirli sınırlamaları vardır. Burada açıklanan yöntem, genç sıçanlarda kullanılmak üzere geliştirilmiştir ve insanlar ile sıçanlar arasındaki sayısız yapısal ve diğer farklılıklar, bu prosedürlerin insanlara çevrilmesini sınırlayabilir. Juvenil sıçanlarda bir terapötiğin lomber intratekal enjeksiyonunu mümkün kılmanın amacı, aday terapötik tedavinin etkinliğini test etmek için juvenil sıçan modelinin kullanımını kolaylaştırmaktır - kesin doğum şeklinin hastalarda uygulama için değiştirilmesi gerekse bile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Donsante, AAV9 vektörlerinin BOS uygulamasıyla ilgili bekleyen bir patentin mucididir.
Acknowledgments
Yazarlar, UT Southwestern'den Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi ve Lacey Stearman'a, intratekal enjeksiyon için genç sıçanların yarattığı zorluğun verimli bir tartışması için teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Jaguar Gen Terapisi'nden (JLFK'ye) sağlanan fonlarla desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A.
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O'connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
