Summary
描述了一种外科手术，用于向幼年大鼠的腰椎池进行注射。这种方法已被用于基因治疗载体的鞘内递送，但预计这种方法可用于多种疗法，包括细胞和药物。
Abstract
基因治疗是一项强大的技术，可以将新基因传递给患者以治疗疾病，无论是引入功能基因、灭活有毒基因，还是提供其产物可以调节疾病生物学的基因。治疗载体的给药方法可以采取多种形式，从用于全身给药的静脉输注到直接注射到靶组织中。对于神经退行性疾病，通常希望将转导偏向大脑和/或脊髓。针对整个中枢神经系统的侵入性最小的方法涉及注射脑脊液 （CSF），使治疗药物能够到达中枢神经系统的大部分。将载体输送到脑脊液的最安全方法是腰椎鞘内注射，将针头引入脊髓的腰椎池。这种技术，也称为腰椎穿刺，已广泛用于新生儿和成年啮齿动物以及大型动物模型。虽然该技术在物种和发育阶段之间是相似的，但鞘内空间周围组织的大小、结构和弹性的细微差异需要在方法中进行调整。本文介绍了一种在幼年大鼠中进行腰椎穿刺以递送腺相关血清型 9 载体的方法。在这里，将 25-35 μL 载体注射到腰椎池中，并使用绿色荧光蛋白 （GFP） 报告基因评估每次注射产生的转导谱。讨论了这种方法的好处和挑战。
Introduction
近年来，随着 FDA 批准治疗脊髓性肌萎缩症、视网膜营养不良、因子 IX 血友病、癌症等，病毒介导的基因疗法的前景终于得以实现 1,2,3,4。目前有无数其他疗法正在开发中。基因疗法旨在将治疗基因传递到患者的细胞中。这种新基因的产物可以替代缺陷内源性基因缺失的活性，抑制有毒基因，杀死癌细胞，或提供一些其他有益功能。
对于影响中枢神经系统 （CNS） 的疾病，将基因治疗载体直接递送至靶组织通常是可取的。非全身性方法有两个好处：它们最大限度地减少了可能由外周转导引起的脱靶副作用，并且它们大大减少了在靶组织中达到足够转导水平所需的载体量5。
有多种方法可以将基因治疗载体输送到中枢神经系统。脑实质内注射，即将载体直接注射到脊髓或脑组织中，可用于输送到指定区域。然而，对于许多疾病，需要中枢神经系统的广泛转导。这可以通过向脑脊液 （CSF）5 输送载体来实现，脑脊液是流入和流入大脑和脊髓及其周围的液体。有三种主要方法可以将载体输送到 CSF。最具侵入性的方法是脑室内分娩，它涉及在颅骨上钻一个毛刺孔，然后将针头穿过大脑进入侧脑室。这会产生整个大脑的转导。然而，该手术可能导致颅内出血，并且该方法通常仅产生有限的脊髓转导6。注射到颅底的脑池大池中侵入性较小，但有损伤脑干的风险。虽然在动物研究中经常使用5，但注射到大池中在临床上不再常规使用7。腰椎穿刺是进入脑脊液的侵入性最小的方法。这包括在两个腰椎之间放置一根针并插入腰椎池。
用于载体输送的腰椎穿刺在成年大鼠和小鼠以及新生小鼠中常规进行 8,9。这项研究的作者最近对幼年大鼠（28-30 日龄）进行了腰椎穿刺，以提供腺相关病毒血清型 9 （AAV9） 载体。在成年大鼠中，将新生儿腰椎穿刺针垂直放置在 L3 和 L4 椎骨之间9。正确放置会导致尾部甩动和脑脊液向上流入针头储液器。然而，在幼年大鼠中，这些读数都无法实现。然后，作者尝试使用以 L5 和 L610 之间的角度插入的 27 G 胰岛素注射器来适应成年小鼠程序。在通常小于P28大鼠的成年小鼠中，这不会产生尾巴甩动，但是通过注射剂的回流可以明显看出不正确的针头放置。然而，在幼年大鼠中，这种方法一致地导致注射剂是硬膜外给药的，这可能是由于成年小鼠和幼年大鼠之间脊髓周围组织层的弹性不同所致。接下来评估导管入路。具体来说，通过腰椎池硬脑膜的切口引入导管，直至胸椎中脊髓;然而，这种方法导致注射液在分娩过程中大量回流出切口部位。尝试使用导针经皮将导管插入鞘内腔也未成功。由于椎板间宽度较窄，导管可能会撞击喙部椎板而无法前进。
在这里，描述了一种 通过 在幼年大鼠中通过腰椎穿刺实现成功且可重复的溶液递送的方法。这种方法可用于病毒载体，也可能用于细胞、药物和其他疗法。
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Protocol
这项研究得到了埃默里大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。本研究使用Sprague-Dawley大鼠（28-30日龄，质量范围约为90-135g，雄性和雌性）。
1. 载体的制备
- 在程序开始时在冰上解冻 AAV9 载体（参见 材料表）。
- 在台式离心机中短暂离心含有载体的微量离心管，以确保所有液体都在管的底部。
- 轻轻轻弹微量离心管，确保溶液充分混合。
2. 回收笼的准备
- 将一个干净的笼子放在电热毯上（参见 材料表），使只有一半的笼子与毯子接触。
- 将毯子的温度设置为 ~37 °C。
3.手术平台的准备
- 在微波炉或水浴中将等温垫（参见 材料表）加热至39°C，使内容物变成液体。
- 将等温垫放在手术平台上，并用干净的吸收性台垫覆盖。
4. 动物准备
- 在透明盒子中用异氟醚麻醉大鼠（遵循机构批准的方案）。使用 5% 异氟醚开始麻醉诱导，每分钟降低 1% 直至达到 2%。将动物保持在 2% 再保持 3 分钟。
- 将装有动物的盒子移至通风橱中，然后打开盒子。
注意：这限制了外科医生对麻醉剂的暴露。 - 使用电动理发器从动物背部去除毛发。
注意：或者，可以使用脱毛膏或手动剃须刀和剃须膏。 - 将动物放在手术平台上，其鼻子位于麻醉鼻锥中。
注意：当毛皮从手术部位取下时，动物可能会开始恢复意识。如果发生这种情况，请按照上述方式再次麻醉。 - 在每只眼睛上涂抹润滑眼膏，以防止在手术过程中角膜干燥。
- 使用聚维酮碘和异丙醇湿巾的三次交替应用对手术区域进行消毒。
- 皮下注射镇痛药。
注：丁丙诺啡通常以0.01-0.05mg / kg的剂量使用，每12小时给药一次。或者，该药物的缓释形式可以以 1 mg/kg 给药一次，以提供 72 小时的充分疼痛控制。请咨询该机构的 IACUC 以获取有关疼痛管理的指南。 - 将 100 μL 1% 利多卡因皮下注射至 L2 至 L6 棘突上方，以提供局部麻醉。
- 将一卷纸巾或直径为 1.5 厘米的管子放在动物下方，刚好靠近臀部。这有助于弯曲脊柱，从而更容易将针头插入两个薄片之间。
- 在动物身上放置一个开窗帘（见 材料表），将开窗放在腰椎上方的中心。
5.暴露腰椎
- 通过捏住动物的每一只爪子并寻找是否存在戒断反应来确认麻醉的深度。
- 使用 #11 手术刀刀片，在从 L2 到 L6 中线的皮肤上创建一个约 3 厘米长的切口。
- 通过在肌肉和皮肤之间插入一把无菌弯曲的手术剪刀，然后打开尖端，使皮肤从肌肉上松开。
- 移除覆盖 L2-L5 棘突的筋膜。
6. 注射器的装载
- 将 25-35 μL 载体（达到所需剂量）移液到无菌微量离心管的盖子中。
- 将整个体积吸入胰岛素注射器中。
注意：在此过程中注意不要吸入空气。
7. 执行注射
- 识别 L5 和 L4 棘突。
注意： L6 直接位于两个髂嵴之间，其棘突应该很容易通过用钝器探测来识别。然后，可以将仪器轻轻地从后面滑行，以找到 L5 和 L4 过程的边界。 - 将一只手轻轻放在动物的尾巴和一条腿上。用手指稳定注射器。
- 将注射器的针头放置在L5棘突的左侧，并与其尾端对齐。放置注射器，使其偏离中线约 30°，距工作台平面向上 30°。
注意：使用手术显微镜更好地识别标志并定位针尖可能会有所帮助。 - 将注射器针头向前推进约 8 毫米，越过 L5 椎板的顶部，然后在 L4 椎板下方进入腰椎池，直到骨头被击中。正确的放置将导致腿和/或尾巴抽搐，而放在腿/尾巴上的拇指可以看到或感觉到。如果没有抽搐，请取下针头并从左侧尝试该过程。如果仍然没有抽搐，请根据需要在 L4/L3 和 L3/L2 之间重复该过程。
- 缓慢按下柱塞约 5 秒。
注意：注射过程中腿部或尾巴可能会抽搐。 - 完全按下柱塞后，将注射器保持在原位约 30 秒，以使压力平衡并最大限度地减少针头拔出时注射液的回流。
- 慢慢取下针头。
8. 切口闭合
- 近似切口的边缘。
- 从伤口的一端开始，使用 4-0 缝合线（参见 材料表）或手术钉闭合切口。
9. 恢复和监控
- 将动物放入预热的笼子中。
- 至少每 15 分钟检查一次动物，直到它完全可以走动。
注意：这应该需要 15 分钟到 45 分钟。 - 在接下来的三天里，至少每天进行一次健康检查。在手术后的前 2 天或根据 IACUC 的要求提供镇痛药。
- 手术后一周，取下缝合线或订书钉。
10. 后续程序
注意：为了确定注射技术的准确性，如上所述注射台盼蓝染料，然后立即对动物实施安乐死（遵循机构批准的方案）并进行椎板切除术以可视化结果。
- 当动物仍处于麻醉状态时，通过 腹膜内 注射以 150 mg/kg 的剂量给予致死剂量的戊巴比妥对其实施安乐死。
- 一旦呼吸和心脏活动停止，打开胸腔以确保死亡。将手术切口从背部延伸到颈部。
- 在棘突两侧平行于脊柱的肌肉中做一个 4 厘米长的切口，尽可能靠近脊柱突。
- 使用细镊子或剪刀，从棘突之间取出肌肉。
- 使用 rongeur 从 L6 向下胸椎移除棘突（参见 材料表）。避免扭转动作，因为这可能会损坏 rongeurs。
- 将 rongeur 的下尖端插入 L5 椎板下方，并通过从中“咬”几下去除覆盖在脊髓上的骨头。
注意：向后拉 L6 棘突可以更容易地插入 rongeur 的尖端。必须注意防止对脊髓造成损害。 - 继续将椎板切除术向喙部扩张至少四个椎板。检查薄片的内表面是否有染料迹象，这可能表明注射失败。
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Representative Results
为了确定注射技术的准确性，使用染料台盼蓝作为治疗剂的替代物。这种染料很容易与蛋白质结合，因此它通常保持在注射到的结构内。这意味着染料可能无法准确预测治疗剂的注射后分布;它只是用来揭示注射的准确性。当成功引入腰椎池时，台盼蓝会与硬脑膜结合，染上脊髓周边的蓝色。然而，当针头无法穿透硬脑膜时，染料最终会进入硬膜外腔。硬脑膜和周围组织（骨骼表面以及连接椎板的韧带和肌肉）都会被染成蓝色。这些图案很容易用肉眼看到。
如果只是简单地在脊髓和脊柱上做一个横向切口，那么正确和错误注射之间的区别就很难评估。取而代之的是，建议使用一对从 L5 椎板开始并向喙部移动的椎板切除术进行椎板切除术。在此过程中必须注意不要损坏硬脑膜。使用解剖显微镜可以使这个过程更容易。 图1 提供了成功进样和仅部分成功进样的比较示例。成功注射后，当针头拔出时，很少或根本没有观察到沿针头轨迹的回流。成功注射后，切除椎板以暴露脊髓，在脊髓内显示台盼蓝，但在骨骼表面则不显示台盼蓝（图1A）。成功注射后，染料在脑干和小脑上也可见（图1B）。相比之下，在注射过程中，染料大量回流到针道和/或骨骼上有染料的可见证据，可以证明部分成功的注射（图1C）。
使用上述程序，以 3 x 1013 载体基因组/mL 的浓度注射 28 μL 表达增强绿色荧光蛋白 （GFP） 的 AAV9 载体，总剂量为 8.4 x 1011 载体基因组/动物。四周后，对动物实施安乐死并灌注4%多聚甲醛10。然后收获大脑和脊髓并准备进行冷冻切片。获得 40 μm 厚的切片并进行 GFP 染色。图 2 提供了使用该载体获得的转导模式示例。脊髓的转导通常最高，特别是在腰椎区域（图2A-C），可能是因为它靠近注射部位。实现了大脑的转导（图2D-F），但是，正如预期的那样，它往往比在脊髓中看到的更有限。
为了说明单个经验丰富的外科医生使用单批病毒所获得的结果的可重复性， 图3 和 图4分别显示了为本研究注射的15只大鼠中每只小脑和皮层的染色切片。这15只大鼠中的7只也显示了颈脊髓的染色切片（图5）。当然，随着剂量、载体批次和外科医生的不同，脑转导的量可能显示出更大的可变性10。
图 1：注射染料后脊髓的暴露。 注射台盼蓝后进行椎板切除术。（A） 在正确注射时，脊髓被染成蓝色，并且在椎板切除术期间去除的骨头上看不到染料（箭头）。（B） 染料也可以在脑干周围观察到。（C） 在注射过程中出现明显反流的注射中，脊髓内的染料较少，并且染料存在于骨骼表面（箭头）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：AAV9-GFP 鞘内递送后实现的转导模式示例。 对 （A） 颈椎、（B） 胸椎和 （C） 腰椎脊髓的 40 μm 厚切片进行免疫组织化学染色以检测 GFP（黑色染色）。在所有水平上都观察到高水平的灰质转导。（D）相比之下，大脑表现出更稀疏的整体转导。左边和右边的框分别在（E）和（F）中被放大。（E） 大部分染色在小脑中观察到，主要在浦肯野神经元（箭头）中。（F） 神经元（箭头）和星形胶质细胞（箭头）在大脑皮层内转导。比例尺：（A-C）325 μm;（D） 5 毫米;（E，F）200μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：小脑中转导的可重复性。 由同一外科医生使用相同剂量和数量的病毒注射的 15 只大鼠在小脑中转导的可重复性。比例尺：1 毫米。图片中的数字表示老鼠的ID号（“litter”）。个人'）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：皮层中转导的可重复性。 由同一外科医生使用相同剂量和数量的病毒注射的 15 只大鼠皮层转导的可重复性。比例尺：500μm。图片中的数字表示老鼠的ID号（“litter”）。个人'）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：颈脊髓中转导的可重复性。 同一位外科医生使用相同剂量和数量的病毒注射的 7 只大鼠颈脊髓中转导的可重复性。比例尺：500μm。图片中的数字表示老鼠的ID号（“litter”）。个人'）。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
多种疾病会影响中枢神经系统。对于那些本质上是隐性和单基因的，如脊髓性肌萎缩症，通过病毒载体提供相关基因的功能拷贝是一种有吸引力的治疗策略。然而，血脑屏障 （BBB） 排除了大多数静脉注射的基因治疗载体11。那些可以穿过 BBB 的药物，例如 AAV9，必须以高剂量给药，以克服由于外周转导引起的载体丢失12。年龄也是一个障碍。对各种 AAV 血清型的环境暴露随着年龄的增长而增加13 岁，并且通常导致产生可以中和治疗载体的抗体14。因此，中枢神经系统疾病的基因治疗载体静脉给药通常仅限于婴儿，不用于晚年诊断的患者。
对于老年患者，直接向 CSF 中注射载体可以在 CNS 中产生广泛的转导，绕过 BBB 和预先存在的抗 AAV 抗体15。由于这种方法是有针对性的，因此也可以使用较低的载体剂量。临床上有两种主要方法：（1） 腰椎穿刺和 （2） 侧脑室注射。后者带来更多风险，但通常提供更大的大脑转导。腰椎穿刺更安全，但转导偏向脊髓。将患者置于特伦德伦堡位可能会增强脑转导，但有关这方面的数据好坏参半16,17。使用导管通过腰椎穿刺到达大池可能在临床上提供更好的选择，但它处于使用的早期阶段5. 将动物模型中制定的方法转化为临床可能存在其他挑战，例如由于脑脊液渗漏导致的载体丢失18 和背根神经节的毒性19。
大多数在啮齿动物中进行的中枢神经系统定向治疗的研究使用新生儿或成年动物（>60 日龄）。新生儿的优点是体型小，允许更高的有效剂量和不成熟的免疫系统，避免了对治疗药物的免疫反应的并发症。然而，就大脑发育而言，新生小鼠或大鼠更能代表人类的胎儿阶段。对于针对5-10岁儿童的治疗，幼年大鼠（25-35天大）在神经发育方面是更好的模型20。由于以前没有描述过用于幼年大鼠的鞘内注射方法，并且为成年小鼠和大鼠建立的方法被证明对该年龄的大鼠无效，因此开发了上述方法。需要明确的是，幼年大鼠不仅比成年大鼠小，而且保护脊髓的硬脑膜的弹性也可能不同，这使得在成年大鼠中穿刺该层的程序在幼年大鼠中无效。
在学习如何在幼年大鼠中进行鞘内注射时，使用染料（如台盼蓝）作为治疗剂的替代物是必要的，并且用户应该对他们成功和可重复地执行该程序的能力充满信心，然后再开始研究治疗剂。要熟练掌握该技术，需要进行练习，以体验当弹道在目标上而不是目标时注射器的感觉。有两个常见的错误。如果接近角度太浅，针将撞击其中一个薄片的顶部或喙部薄片的背面。不会有抽搐，针头前进的距离将比 8 毫米少几毫米。如果接近角度太大，则存在针头穿过两个薄板并穿透腹腔的风险。发生这种情况时，针头将前进到 8 毫米以上。如果发生这种情况，请取下针头，重新定位，然后重试。在少数情况下，这种情况发生，在撤出和重新定位之前短暂进入腹腔几毫米并没有对动物造成任何明显的持久伤害。
已经发现，观察对针头放置的物理反应对于实现该过程的高成功率的可重复性至关重要。当没有反应时，注射的成功率很低。然而，在某些情况下，动物需要在多个部位进行尝试才能获得反应，并且在先前的针迹中的一个或多个中观察到微量的染料。在硬膜外腔中没有观察到染料，这表明之前的一些针刺已经穿透了硬脑膜而没有产生尾巴或腿抽搐。由于回流是最小的（类似于在注射时的针头轨迹中观察到的），因此人们认为在这些情况下，先前的针刺对给药效果的影响可以忽略不计。
一旦一个人熟练掌握了分娩技术，就可能会遇到第二个非手术挑战。具体来说，在成年大鼠（~70日龄）中，AAV9载体鞘内递送至脊髓和大脑的效力可能因批次而异，即使它们由相同的载体核心产生。一些批次将按预期执行，沿其长度在脊髓灰质中产生转导。然而，其他的则无法穿透灰质，主要转导背根神经节10。造成这种变异性的原因尚不清楚，因为载体 在体外 和直接注射到脊髓中时是有效的。建议在开始大型研究之前，对任何新批次的病毒进行3-4只动物的初步研究，以确认新批次的表现符合预期。可以使用蛋白质转基因产物的免疫组织化学或免疫荧光染色或使用定量 PCR 或 ddPCR21 量化转基因 mRNA 或载体基因组的数量来评估效力。除了区分病毒批次的未知变量外，动物年龄、注射量、递送速度和载体浓度的微小差异也可能导致结果的可变性。在开始一项大型研究之前，可能需要针对每种病毒或其他候选治疗剂进行优化。
一旦接受过培训，经验丰富的外科医生可以在大约30分钟内完成幼年大鼠的鞘内注射程序，从麻醉诱导到恢复期开始。这使得大型队列可以在短时间内得到治疗。手术恢复也很快。大多数动物在20-30分钟内正常行走。在进行了 200 多次此类手术后，该手术没有遇到任何不良影响。
最后，在外科手术过程中尽量减少动物的痛苦和确保动物的福利是最重要的考虑因素。因此，需要正确使用麻醉剂和镇痛剂，并且在手术过程中必须保持体温，直到动物从麻醉中完全恢复。相关监管机构和不同机构的兽医人员可能对这些主题有不同的要求和建议。该程序中描述的麻醉剂和镇痛剂的使用是在与埃默里大学兽医和 IACUC 工作人员协商后制定的。研究人员应与当地兽医和 IACUC 密切合作，以实现所需的目标。
此过程存在某些限制。这里描述的方法是为用于幼年大鼠而开发的，人类和大鼠之间的无数结构和其他差异可能会限制这些程序对人类的翻译。在幼年大鼠中启用腰椎鞘内注射治疗剂的目的是促进使用幼年大鼠模型来测试候选治疗药物的疗效 - 即使需要改变精确的给药方式以应用于患者。
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Disclosures
Donsante 博士是 AAV9 载体脑脊液给药的专利的发明人。
Acknowledgments
作者要感谢德克萨斯大学西南分校的 Steven Gray、Matthew Rioux、Nanda Regmi 和 Lacey Stearman 对幼年大鼠鞘内注射所带来的挑战进行了富有成效的讨论。这项工作部分得到了Jaguar Gene Therapy（JLFK）的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
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